Вы здесь:
МЕДИЦИНА
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ. ЭФФЕКТИВНОСТЬ ВОЗДЕЙСТВИЯ БЕНЗОИЛПЕРОКСИДА НА СТАФИЛОКОККОВУЮ И ДРОЖЖЕВУЮ МИКРОФЛОРУ IN VITRO
Автор: В. Г. Арзуманян, Т. И. Кабаева, Е. В. Зайцева, Н. А. Орлова
В. Г. Арзуманян*, Т. И. Кабаева**, Е. В. Зайцева*, Н. А. Орлова***
* Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова РАМН,
** Центральный научно-исследовательский кожно-венерологический институт МЗ и СР РФ
*** Центр лечения угрей и реабилитации кожи
Бензоилпероксид (БП) - антисептик, широко используемый с конца 80-х годов для комплексного лечения вульгарных угрей (акне) [9]. Со времени его первого применения опубликовано множество работ, посвященных эффективности БП при лечении акне. Однако нам удалось обнаружить лишь одно исследование, касающееся действия БП на микроскопических обитателей кожи in vitro [6]. В работе представлен экспериментальный материал по скорости отмирания клеток 2 штаммов стафилококков, 2 штаммов пропионовых бактерий и 1 штамма дрожжей рода Pityrosporum (современное название - Malassezia) в присутствии БП. Показано, что период десятикратного снижения численности данных популяций составлял от 5,5 до 20 мин. Однако авторы не ставили перед собой цель определить минимальные ингибирующие рост концентрации БП. В исследование также не были включены микроорганизмы, которые в современных условиях можно считать причинно-значимыми в развитии акне - St. aureus и St. haemolyticus [3].
Цель настоящей работы - определение минимальных ингибирующих концентраций (МИК) БП в отношении причинно-значимых стафилококков, а также некоторых других групп микроорганизмов, заселяющих кожу человека в норме и при различных патологических процессах.
В ходе исследования мы использовали 22 штамма дрожжей и 20 штаммов стафилококков из коллекции Лаборатории клинической микробиологии Научно-исследовательского института вакцин и сывороток им. И. М. Мечникова РАМН (табл. 1). Идентификацию культур проводили по разработанным ранее схемам [1, 2]. Для экспериментов применяли 1 - 2-суточные культуры, выращенные на соответствующих плотных средах: стафилококки и нелипофильные дрожжи - на глюкозо-пептон-дрожжевой среде, а липофильные дрожжи рода Malassezia - на модифицированной среде Диксона. В среды для дрожжей вносили антибиотик.
БП ("Aldrich", кат. N 22887 - 7) растворяли в диметилсульфоксиде (предельная концентрация при нагревании до 70°С составила 200 мг/мл) и вносили в ячейки круглодонного планшета объемом 200 мкл. В первую ячейку ряда вносили 10 мкл концентрата и 10 мкл стерильной дистиллированной воды, суспендировали и переносили 10 мкл смеси в следующую ячейку, содержащую 10 мкл воды и т.д. (метод двукратных микроразведений) [7]. Таким образом, исходная концентрация БП составила 5000 мкг/мл. Оценка действия диметил-сульфоксида показала, что максимальная использованная концентрация этого растворителя - 5 мкл/200 мкл среды - не влияла на рост микроорганизмов.
Далее в каждую ячейку ряда вносили по 190 мкл суспензии клеток определенной культуры микроорганизмов в соответствующей питательной среде. Концентрация дрожжевых клеток в суспензии составляла 103 - 104 КОЕ/мл, а стафилококков - 104 - 106 КОЕ/мл. Планшеты инкубировали при температуре 32°С в течение нескольких суток.
Показателем эффективности воздействия БП был рост клеток, который проявлялся в наличии осадка на дне ячеек планшета. За МИК принимали ту наименьшую концентрацию БП, при которой не отмечался рост клеток в момент оценки (совершенно прозрачная среда).
В опытах по оценке динамики гибели клеток дрожжей под действием БП исход-
стр. 20
--------------------------------------------------------------------------------
Таблица 1. Минимальные концентрации бензоилпероксида, ингибирующие рост культур оппортунистических дрожжей и стафилококков
Дрожжи и стафилококки (род/ вид / коллекционный номер)
МИК, мкг/мл
2 сут
7 сут
Malassezia furfur N 607
1250
1250
Malassezia globosa N Y
1250
1250
Malassezia sympodialis N N
1250
1250
Rhodotorula mucilaginosa N 132
2500
2500
Rhodotorula aurantiaca N 786
1250
1250
Trichosporon cutaneum N 18
625
625
Trichosporon ovoides N 566
1250
1250
Geotrichum sp. N780
1250
2500
Geotrichum sp. N M
2500
2500
Candida albicans N 628
625
625
Candida albicans N 689
1250
1250
Candida albicans N 735
1250
1250
Candida albicans N 741
1250
1250
Candida albicans N 815
2500
2500
Candida albicans N 820
1250
1250
Candida albicans N 860
2500
2500
Candida albicans N 927
2500
2500
Candida albicans N 932
2500
2500
Candida albicans N 934
1250
1250
Candida albicans N1135
2500
2500
Staphylococcus epidermidis N 1
625
1250
Staphylococcus epidermidis N 2
1250
1250
Staphylococcus epidermidis N 4
1250
1250
Staphylococcus epidermidis N 6
2500
2500
Staphylococcus epidermidis N 9
1250
1250
Staphylococcus epidermidis N 25
1250
1250
Staphylococcus epidermidis N 27
2500
2500
Staphylococcus epidermidis N 28
625
2500
Staphylococcus aureus N 5
1250
1250
Staphylococcus aureus N 8
1250
1250
Staphylococcus aureus N 12
1250
1250
Staphylococcus aureus N 13
1250
1250
Staphylococcus aureus N 14
1250
1250
Staphylococcus aureus N 29
2500
2500
Staphylococcus aureus N 30
2500
2500
Staphylococcus aureus N 31
1250
1250
Staphylococcus aureus N 33
1250
1250
Staphylococcus haemolyticus N 17
1250
1250
Staphylococcus haemolyticus N 23
1250
1250
Staphylococcus haemolyticus N 26
1250
1250
ное содержание живых клеток составляло примерно 107 КОЕ/мл, а концентрация БП - 5000 мкг/мл. Инкубацию суспензий с БП проводили при температуре 32°С в течение 0 - 2,5 ч, затем клетки осаждали центрифугированием, окрашивали 2 мМ раствором бромкрезолового пурпурного в 0,5 М калий-фосфатном буфере рН 4,6 [12], микроскопировали при 175 0-кратном увеличении и подсчитывали количество живых и убитых клеток. Каждый эксперимент включал 300 - 500 клеток.
Рис. 1. Динамика гибели клеток дрожжей под действием бензоилпероксида: исходное содержание живых клеток - примерно 107 КОЕ/мл; концентрация БП - 5000 мкг/мл
стр. 21
--------------------------------------------------------------------------------
Рис. 2. Гибель клеток Malassezia globosa N Y под действием бензоилпероксида в концентрации 5000 мкг/мл; 1 малое деление на шкале окуляр-микрометра соответствует 1 мкм: а - исходная культура; б - 92,2% мертвых клеток в течение 30 мин; в - 2,5 ч - клеточный дебрис
Таблица 2. Зависимость величины минимальной ингибирующей концентрации бензоилпероксида в отношении St. aureus N 33 от плотности клеточной суспензии
КОЕ/мл
МИК, мкг/мл 8сут
109
2500
108
1250
107
1250
106
1250
105
1250
104
1250
103
1250
102
1250
В табл. 1 представлены данные по эффективности воздействия БП на культуры клеток дрожжей и стафилококков. МИК оценивали на 2-е и 7-е сутки после засева. Различий в значениях МИК между данными временными точками у большинства культур не отмечено. Кроме того, в значениях МИК преобладали штаммовые, а не родовые/видовые различия, причем величины МИК варьировали в пределах от 625 до 2500 мкг/мл.
Динамику гибели клеток дрожжей под действием БП оценивали на 3 культурах дрожжей (рис. 1, 2). Скорость отмирания клеток (% снижения живых клеток по отношению к контролю в минуту) за первые 30 мин инкубации с БП составляла: 2,27 - для Malassezia furfur N607; 2,48 - для Candida albicans N927; 3,06 - для Malassezia globosa NY. У всех 3 штаммов дрожжей наблюдали полную гибель клеток через 2,5 ч.
Зависимость МИК БП в отношении St.aureus N33 от плотности клеточной суспензии представлена в табл. 2. МИК БП для данной культуры составила 1250 мкг/мл для плотности клеток в диапазоне 102 - 108 КОЕ/мл и повышалась всего до 2500 мкг/мл при 109 КОЕ/мл.
Установленный характер взаимосвязи между концентрацией клеток (их размерами) и МИК связан, очевидно, с неспецифическим механизмом действия БП (см. табл. 1). Как и прочие перекисные соединения, БП вызывает деструкцию клеточной стенки, окисляя двойные связи в ненасыщенных жирных кислотах мембран. По всей вероятности, не имеет особого значения, будет ли в данной микробной клетке под действием БП образовано условно 10 или 10000 пор, клетка все равно погибает. Скорость гибели должна зависеть от концентрации БП.
При обычной плотности популяции микроорганизмов на поверхности кожи (не более 103 - 105 клеток/см2 ) МИК БП составляет 1250 - 2500 мкг/мл. Простой расчет показал, что при использовании 5% геля на 1 см2 кожи наносится всего 5 - 10 мкл, т.е. 250 - 500 мкг БП, что в 5 - 10 раз меньше МИК. Однако при повышении концентрации
стр. 22
--------------------------------------------------------------------------------
БП возможны побочные эффекты. Цитотоксичность и аллергенность этого препарата известны [4]. Согласно данным литературы, гибель клеток человеческих фибробластов происходит в минутном режиме. При лечении акне наряду с использованием антибиотиков и топических ретиноидов рекомендуют короткие курсы применения 5% геля (1 - 3 нед), содержащего БП [5]. Уже в течение 48 ч происходит значительное снижение численности микроорганизмов, персистирующих на коже. Во многих исследованиях, проведенных in vivo, отмечено отсутствие развития у бактерий резистентности к этому препарату, что, очевидно, связано с неспецифическим механизмом его действия [11].
Антифунгальная активность БП практически не освещена в литературе, однако имеются сообщения об успешном использовании этого препарата при лечении пролежней, осложненных грибковой инфекцией [8]. Кроме того, есть информация о разработке композиций, содержащих имидазол и БП [10].
Таким образом, БП является перспективным препаратом для лечения поверхностных микозов. Он проявляет выраженную активность в отношении клинически значимых дрожжевых грибов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Арзуманян В. Г. Дрожжи рода Malassezia: таксономия, идентификация, значение в экологии и патологии человека // В кн.: Новое в систематике и номенклатуре грибов. Под ред. Ю. Т. Дьякова, Ю. В. Сергеева. - М.: Нац. академия микологии; изд-во "Медицина для всех", 2003. - С. 458 - 492.
2. Арзуманян В. Г., Зайцева Е. В., Темпер Р. М. и соавт. Определение кокковой и дрожжевой микрофлоры у больных с кожной патологией / Пособие для врачей. - М., 2004. - 30 с.
3. Кабаева Т. И., Арзуманян В. Г., Зайцева Е. В., Орлова Н. А. Изучение чувствительности штаммов Staphylococcus spp., выделенных от пациентов с акне, к антибиотикам и антисептикам // Иммунопатология, аллергология, инфектология. - 2004; 4: 31 - 33.
4. Bester M.J., Erasmus E., Pretorius E. Presenting an in vitro cell culture model to determine the cytotoxic effect of benzoyl peroxide vapours // SADJ. - 2003; 58(5): 183 - 186, 188.
5. Bojar R.A., Cunliffe W.J., Holland K.T. The short-term treatment of acne vulgaris with benzoyl peroxide: effects on the surface and follicular cutaneous microflora // British Journal of Dermatology. - 1995; 132(2): 204 - 208.
6. Cove J.H., Holland K.T. The effect of benzoyl peroxide on cutaneous micro-organisms in vitro // Journal of Applied Bacteriology. - 1983; 54(3): 379 - 382.
7. Espinel-lngroff A., Rodrigues-Tudela J.L., Martinez-Suarez J.V. Comparison of two alternative microdilution procedures with the National Committee for Clinical Laboratory Standarts reference macrodilution method M27-P for in vitro testing of fluconazol-resistant and susceptible isolates of Candida albicans// J.Clin.Microbiol. - 1995; 33: 3154 - 3158.
8. Fernandez Vozmediano J.M., Alonso Blasi N., Almenara Barrios J. et al. Benzoyl peroxide in the treatment of decubitus ulcers // Medicina Cutanea Ibero-Latino-Americana. - 1988; 16(5): 427 - 429.
9. Fulton J.E., Farzad-Bakshandeh A., Bradley S. Studies on mechanism of action of topical benzoyl peroxide and vitamin A acid in acne vulgaris// J.Cutaneous Pathol. - 1974; 1: 191.
10. Gartz J.E. Chemical stability of antimycotic imidazole-dibenzoyl peroxide mixtures in various galenic bases // Pharmazie. - 1984; 39(4): 276 - 277.
11. Goulden V. Guidelines for the management of acne vulgaris in adolescents (Review) // Paediatric Drugs. - 2003; 5(5): 301 - 313.
12. Kurzweilova H., Sigler K. Fluorescent staining with bromocresol purple: a rapid method for determining yeast cell dead count developed as an assay of killer toxin activity // Yeast. - 1993; 9: 1207 - 1211.
стр. 23
Комментарии:
ИНФОРМАЦИЯ ПО РЕФЕРАТУ:
СТУДЕНТАМ! Уважаемые пользователи нашей Коллекции! Мы напоминаем, что наша коллекция общедоступная. Поэтому может случиться так, что ваш одногруппник также нашел эту работу. Поэтому при использовании данного реферата будьте осторожны. Постарайтесь написать свой - оригинальный и интересный реферат или курсовую работу. Только так вы получите высокую оценку и повысите свои знания.
Если у вас возникнут затруднения - обратитесь в нашу Службу заказа рефератов. Наши опытные специалисты-профессионалы точно и в срок напишут работу любой сложности: от диссертации до реферата. Прочитав такую качественную и полностью готовую к сдаче работу (написанную на основе последних литературных источников) и поработав с ней, вы также повысите ваш образовательный уровень и сэкономите ваше драгоценное время! Ссылки на сайт нашей службы вы можете найти в левом большом меню.
ВЕБ-ИЗДАТЕЛЯМ! Копирование данной работы на другие Интернет-сайты возможно, но с разрешения администрации сайта! Если вы желаете скопировать данную информацию, пожалуйста, обратитесь к администраторам Library.by. Скорее всего, мы любезно разрешим перепечатать необходимый вам текст с маленькими условиями! Любое иное копирование информации незаконно.
Поиск по БЕЛОРУССКИМ рефератам 
